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为什么我需要使用内部参数进行WB实验?

来源:365bet365娱乐城 作者:wwwbet36365娱乐场 发布时间:2019-01-28

优选的方法是蛋白质印迹,以研究基因的表达产物是否正确或比较表达产物量的相对变化。
因为它是西方的
印迹操作相对简单方便,可以定性分析表达产物,也可以显示目标蛋白量的相对变化。
柔软时,它是西方的。
你很容易染色,但如果它不柔软则非常麻烦。它不能产生结果,是误报,最后有很多乐队。一抗有问题,或二抗有问题吗?毕竟,由于大分子,抗体和活性生物抗原的活性不如1 + 1那么清晰。然而,使用这种不确定的试剂来确定知识很少的表达产物肯定是不确定的。
所以,严格的西部。
实验印迹设计需要一个极好的参考系统,对分析实验结果非常有用。
特别是当实验出现问题时,很容易发现使用参考系统而不会伤到头部。
优良参考系统,一般地,(其用于确定对应于一个蛋白质条带的分子量)的分子量标记,(如果它应该有一个预感应控制也诱导表达系统)的空白矢量控制,已知的标准量积极控制数量;内部参考。
然而,由于经济上的限制和懒惰,这个国家的许多人都在西方
印迹经常省略参考,并且在结果有问题时无法分析结果。即使有结果,结果的分析也可能受到影响。
内部引用通常是被忽视的元素。
我们知道我们想要使用西部
印迹比较了靶蛋白在不同条件下或不同组织中的相对表达。前提条件是加载相同数量的单元格并获得比较基础。
如果特殊表达量不大,样品量的差异可能会影响结果分析。
所以你需要一个内部参考。
内部引用是内部引用。
对照(control)是指通常由维持基因编码的蛋白质,用于表达哺乳动物细胞(管家)。
其在组织和细胞中的表达相对恒定,并且当检测到蛋白质表达水平的变化时经常用作参考。
在Western印迹
在实验中,蛋白质提取,蛋白质定量,等量蛋白上样的,膜转染,所述目标蛋白的抗体温育后,除了步骤,例如彩色显影,还需要内部参考检测器。存在实验误差以保证实验结果的准确性。
在海外发表的一篇文章中,Western Blotting
通常的做法是修改实验结果的内部参数。
然而,西方国家仍有许多研究人员。
在印迹实验中,内部标准的使用被忽略并确定为蛋白质浓度等于彼此比较的样品量的唯一方式。
然而,一些量化蛋白质浓度的方法具有局限性,并且不能准确地确定一些样品的精确蛋白质浓度。
通过UV方法的直接定量适合于以相对简单的组合物测试相对纯的蛋白质。与比色法相比,操作简单,但易受DNA等平行物质的干扰。
需要高浓度蛋白质的干扰和低灵敏度。
蛋白质浓度的比色定量通常具有BCA,Bradford,Lowry。
几种方式
BCA和Lowry方法都易受蛋白质和去污剂之间的干扰。
布拉德福德
使用一系列Lowry干涉BCA,这种方法的灵敏度最高
反应还原剂(DTT,巯基乙醇等)是相容的。
但是,它对洗涤剂仍然很敏感。主要缺点是如果标准不同,则相同样品的结果可能会出现很大差异。此外,蛋白质定量后电泳需要相等的电荷,并且在该过程中存在操作错误。
在西方
使用传输实验的内部参数,您可以轻松纠正量化步骤和加载步骤生成的错误。
在西方
使用在印迹内部标准,事实上,在WB过程中使用内标物的相应的抗体,内标检测使得内部标准的表达可被检测,而检测到目标产物。它存在于各种组织和细胞中。
样品中的表达是相对恒定的,并且每个样品中的内部参考量可用于校正加载误差,使得半定量结果更可靠。
此外,内标的使用表明蛋白质转移条件是
WesternBlot彩色或发光系统的完整和完整开发是正常的。
实验结果的分析实际上非常简单。如果样品中蛋白质的量有限,则仅进行一次电泳迁移试验,并分别检测内部参数和目标蛋白质的量。
将每个样品中的蛋白质量除以其内部参考量。
所得到的值是靶蛋白的内部基准校正后的各样品中的相对量,然后样品之间的比较分析的值,在不同的样品之间的靶蛋白含量的实际变化的结果获得。
如果样品数量足够,
可以首先检测到内部参考,和样品和每个样品的样品体积之间的参考样本匹配的内部颜色波段按照差大小被调整,和Western样品它还变形。
在转移实验中,内部参数匹配。如果内部参数匹配,则可以在不同样品之间进行靶蛋白的表达分析。
这有点麻烦,但你可以保证结果更引人注目,更可靠。毕竟,我们的实验是一项严格的工作。
附着:Western印迹实验中使用的方法如下。
首先,超简单标记的内标法:然而,根据常规方法,将第二抗体加入到用HRP标记的内标抗体中。
正常内标:如果目标蛋白的分子量与所选内标蛋白的分子量没有显着差异,则可以孵育抗体用于显色和颜色检测。
此后,用条带缓冲液洗涤膜上的抗体,并重复孵育抗体并检测内部参照蛋白的颜色。
3.如果目标蛋白的分子量与所选内参比蛋白的分子量显着不同,则在转录后预干燥,并根据蛋白大小将膜分成两部分。标记和内部参考蛋白和内部参考蛋白是靶蛋白。
然后将两种膜与内部参考蛋白的抗体一起温育,并将靶蛋白的抗体和第二抗体温育并显色。



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